对生物体液中的生物标志物的分析,也常被称为液体活检。液体活检有巨大的基础研究和临床使用潜力,能以高灵敏度和低侵入性的方式对疾病进行诊断和预后分析。大多数液体活检研究都集中在血循环当中的核酸上。历史上,cfDNA 最先进入研究者的视野,但最近一些年来,cfRNA 的研究也逐渐获得了关注。

cfRNA是什么

cfRNA(Cell-free RNA)是位于细胞外的游离 RNA分子。这些分子在正常生理过程或病理条件下被细胞释放。cfRNA已成为各种疾病当中极有前途的生物标志物,包括癌症、多种传染病、心血管疾病和神经系统疾病等等。

cfRNA 由多种类型的 RNA 构成,根据分子长度的不同,cfRNA大致可以划分为两大类:小RNA和长RNA。小RNA长度约为 18-40 nt,最长不超过 200 nt。因为它们都是非编码 RNA,因此也被称为 sncRNA(Small Non-coding RNA)。cfRNA 当中的小 RNA 包括以下几种主要亚型:微小RNA(miRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)还有 rRNA 衍生的小 RNA(rsRNA)。另一方面,长RNA的长度则往往可以达到数百到数千nt,主要包括mRNA、长非编码RNA(lncRNA)和环状RNA(circRNA)。

cfRNA的来源样品

凡是来源于细胞外的游离 RNA 分子都属于 cfRNA 大家庭。在临床上最常见的 cfRNA 样品来源就是血浆和血清,这类样品当中不存在细胞结构,但含有丰富的游离核酸,其中就包括 cfRNA。除了血浆和血清以外,尿液、脑脊液、乳头溢液、玻璃体液等不含细胞结构的体液样品也可以作为 cfRNA 的来源。此外,即便某些体液当中存在细胞结构(例如全血、精液),我们仍然可以先行分离其中的外泌体,得到这些体液样品当中外泌体来源的 cfRNA。这一样品获取思路还不仅仅局限于体液,对于培养细胞的上清乃至是组织样品,也都可以考虑获取其外泌体来源的 cfRNA。总之,cfRNA 的来源样品极其丰富,许多类型的样品均可进行 cfRNA 测序实验。

cfRNA中常见的分子类型

miRNA

miRNA 是一类研究得比较早的小 RNA。miRNA 最初的转录产物前体是长链的 pri-miRNA,随后被剪接为长度约数十到百余 nt 的发夹形 pre-miRNA,最终被加工为长度约 18-24 nt 的成熟 miRNA。miRNA参与调节基因表达,通过结合目标mRNA抑制其翻译或促进其降解。

图自 Cai Y, Yu X, Hu S, Yu J. A brief review on the mechanisms of miRNA regulation. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2009;7(4):147-154. doi:10.1016/S1672-0229(08)60044-3 

miRNA 参与各种生物过程的调控,包括发育、细胞增殖和凋亡。miRNA表达失调已被证明与各种疾病的发病机制相关,包括癌症、心血管疾病和神经系统疾病。例如:

1.癌症:多项研究显示,miR-21在乳腺癌、肺癌、结肠癌和胰腺癌中过表达,而 miR-205在乳腺癌中下调。这些 miRNA 可作为癌症诊断的潜在生物标志物。

2.心血管疾病:miR-1和miR-133a在心肌中表达,在心力衰竭中下调,使它们成为潜在的诊断生物标志物。此外,miR-208b已被证明是心肌梗塞的生物标志物。

3.神经系统疾病:miR-9、miR-29b和miR-132在阿尔茨海默病中被下调,使它们成为诊断该病的潜在生物标志物。此外,miR-124在帕金森病中被下调,使其成为诊断的潜在生物标志物。

piRNA

piRNA是一类长度约 24-32 nt 的小 RNA,早期主要在生殖细胞发育的背景下研究。它们通过与 PIWI 蛋白的结合形成 RISC 复合物,参与转座子的沉默和维持基因组稳定性。

图自 Iwasaki YW, Siomi MC, Siomi H. PIWI-Interacting RNA: Its Biogenesis and Functions. Annu Rev Biochem. 2015;84:405-433. doi:10.1146/annurev-biochem-060614-034258 

最近的研究表明,piRNA也存在于体细胞中,并可能在这些细胞中发挥调节基因表达的作用,并且在癌症和神经退行性疾病等多种疾病当中发挥作用: 

1.癌症:piRNA-651 促进乳腺癌和非小细胞肺癌的发生,piR-823 则在食管鳞癌当中发挥作用,piR-1245 则有在结直肠癌当中发现。

2.神经退行性疾病:piR-38240 and piR-34393 在阿兹海默症当中上调,血液外泌体当中的 piR-has-92056, piR-hsa-150797, piR-hsa-347751, piR-hsa-1909905, piR-hsa-2476630, and piR-hsa-2834636 等多种 piRNA 则可以用作帕金森病的生物标志物。

tsRNA

tsRNA(tRNA-derived small RNA)是源于 tRNA 的小片段,由酶切割tRNA或者tRNA前体所产生,根据切割片段的来源和长度的不同,可细分为tRF、tiRNA、tRNA halves等。

图自 Chen Y, Shen J. Mucosal immunity and tRNA, tRF, and tiRNA. J Mol Med (Berl). 2021;99(1):47-56. doi:10.1007/s00109-020-02008-4 

研究显示,tsRNA 拥有丰富的生物学功能,至少包括:

1.调控 mRNA 稳定性。tsRNA具有类似于miRNA的功能,可以通过靶向mRNA来调节其稳定性,从而调节mRNA的稳定性。

2.调控蛋白质翻译。tsRNA 调节蛋白质翻译有以下几种方式:

(1)增强翻译过程:在小鼠和人类的研究中,tsRNA LeuCAG可以与编码核糖体蛋白RPS28的mRNA结合,从而增强翻译过程;

(2)抑制翻译过程:tsRNA能够与核糖体小亚基16S rRNA结合,从而抑制翻译过程;

(3)调控翻译起始:tsRNA能够形成多聚体,代替翻译起始因子eIF4复合物,从而抑制翻译起始过程。

3.tsRNA作为表观遗传调控因子,可以通过影响不同的表观遗传过程来调节基因的表达。例如,tsRNA可以与PIWI蛋白相互作用,促进H3K9甲基化。

4.tsRNA可以通过与成熟tRNA竞争结合到反转录转座子的引物结合位点上,阻断其逆转录,从而调节转座子的活性。

研究显示 tsRNA 参与调节基因表达和压力应对。tsRNA 在压力或细胞损伤条件下生成,在多种疾病中其表达增加。因此,tsRNA 可以作为疾病的分子标志物。迄今为止,已经有研究显示 tsRNA 在以下类型的疾病当中作为生物标志物:

1.病毒感染:在HBV或HCB病毒感染的组织细胞中,tsRNA的丰度会发生显著变化。

2.应激反应:tsRNA在急性炎症、衰老、能源限制、急性肾脏疾病和组织损伤等情况下,对外周循环具有敏感性,因此可能是一种有用的非侵入性生物标志物。

3.癌症:已有研究表明,在多种癌症中,tsRNA受到异常调节。这些异常调节的tsRNA可能成为疾病诊断、靶向治疗和预后等方面的生物标志物。

4.神经退行性疾病:tsRNA 在帕金森病、脑桥小脑发育不全、肌萎缩性侧索硬化症、阿兹海默症和其他神经退行性疾病的患者中发生改变。

rsRNA

除了 tRNA 以外,另一种丰富极高的管家 RNA 也能衍生出一些小 RNA,那就是 rRNA 所衍生出的 rsRNA。研究显示,rsRNA成熟的精细胞以及多种体细胞中都存在。rsRNA 和 tsRNA 一起构成了特定种类细胞的“coding signature”。目前关于 rsRNA 的研究还不多,但由于其与 tsRNA 相似的大小和生成机制,因此测序方法和数据分析方法可以基本沿用。我们完全可以预期 rsRNA 的研究涌现出更多成果来。

图自 Chu C, Yu L, Wu B, et al. A sequence of 28S rRNA-derived small RNAs is enriched in mature sperm and various somatic tissues and possibly associates with inflammation. J Mol Cell Biol. 2017;9(3):256-259. doi:10.1093/jmcb/mjx016 

总之,包括miRNA、piRNA、tsRNA 和 rsRNA 在内的 sncRNA,是可能作为各种疾病生物标志物的重要分子。这些 sncRNA 在血液、尿液、脑脊液等体液当中广泛以 cfRNA 的形式存在,因此检测 cfRNA 当中的 sncRNA 是研究疾病分子标志物的一条捷径。

那么,cfRNA 当中是否也存在长链 RNA 呢?在一般的认识当中,人们普遍认为血液等体液当中很少存在长链 RNA,因此很难作为疾病分子标志物。然而,近来的多项研究显示,长链 RNA 亦可存在在于细胞外的体液当中,其中不乏一些长链 cfRNA 具有作为生物标志的潜力。以下我们就带来几篇长链 cfRNA 研究的例子:

circRNA

环状 RNA 因为不存在暴露的 5’ 端或 3’ 端,可以耐受 RNA 外切酶,具有比较稳定的结构,有利于其在体液当中的长期存在。因此,在长链 cfRNA 当中,circRNA 是最常见的研究对象。

circRNA 在各种疾病中均表现出不同程度的异常表达,包括癌症、心血管疾病、神经退行性疾病等。例如:

1.癌症:多项研究表明,circRNA 在多种癌症类型中表达异常,包括肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌和结直肠癌等。一些 circRNA 已被确定为癌症的潜在诊断生物标志物,如乳腺癌中的 hsa_circ_0000520,胃癌中的 hsa_circ_0005075 和结直肠癌中的 hsa_circ_0012673。

2.心血管疾病:circRNA 已被发现参与心肌梗死、心力衰竭和动脉粥样硬化等心血管疾病的发生和发展。例如,hsa_circ_0001879 已被确定为急性心肌梗死的诊断生物标志物,而 hsa_circ_0001445 和 hsa_circ_0004104 被认为是心力衰竭的潜在生物标志物。

3.神经退行性疾病:circRNA 异常表达在多种神经退行性疾病中被观察到,如阿茨海默病、帕金森病和多发性硬化症等。一些 circRNA 被确定为这些疾病的潜在诊断生物标志物,如阿茨海默病中的 hsa_circ_0001445 和帕金森病中的 hsa_circ_0004358。

mRNA

cfRNA 当中也能检测到像 mRNA 这样的长链 mRNA。例如,在云序客户的一项研究当中,研究者在帕金森病患者和健康组志愿者的血浆外泌体当中进行了全转录组测序,发现了包括 NDUFB7 基因的 mRNA 转录本 ENSG00000099795 在内的多个长链 RNA 转录本在帕金森病人的血浆当中显著上调。

图自 Wang Y, Liu Y, Jin Z, Liu C, Yu X, Chen K, Meng D, Liu A, Fang B. Association Between Mitochondrial Function and Rehabilitation of Parkinson's Disease: Revealed by Exosomal mRNA and lncRNA Expression Profiles. Front Aging Neurosci. 2022 Jun 16;14:909622. doi: 10.3389/fnagi.2022.909622. PMID: 35783124; PMCID: PMC9244703. 

lncRNA

长链非编码 RNA(lncRNA)在 cfRNA 也占有一席之地。例如,云序客户的一项研究当中发现,LUCAT1是一个最初发现于吸烟相关的肺癌当中的 lncRNA。在该项研究中当中,研究人员在肺腺癌患者的血清外泌体中发现了LUCAT1 的上调现象。用这个 lncRNA 作为肺腺癌的分子标志物,AUC 可以高达 0.852。作者还通过后续的一系列实验,发现了 LUCAT1/miR-4316/VEGF-A 调控轴。

图自Wang L, Xie Y, Wang J, Zhang Y, Liu S, Zhan Y, Zhao Y, Li J, Li P and Wang C (2022) Characterization of a Novel LUCAT1/miR-4316/VEGF-A Axis in Metastasis and Glycolysis of Lung Adenocarcinoma. Front. Cell Dev. Biol. 10:833579. doi: 10.3389/fcell.2022.833579 

cfRNA研究典型案例 

论文标题:A urine extracellular vesicle circRNA classifier for detection of high-grade prostate cancer in patients with prostate-specific antigen 2–10 ng/mL at initial biopsy

发表期刊:Molecular Cancer(IF=41.444)

样品类型:尿液外泌体

测序样品数:11+11

训练集样品数:72+191

验证集样品数:497 & 505

研究者对 11 个高级别前列腺癌(high-grade prostate cancer)患者和 11 个轻度前列腺增生患者的尿液外泌体当中的 cfRNA 进行了测序,发现了 18 个 circRNA 在前列腺癌患者组当中显著上调。随后研究者扩大样本数量,在 72 个疾病组和 191 个对照组个体的尿液外泌体当中通过 ddPCR 定量确认了这 18 个 circRNA 在疾病组当中的上调。作者随后基于这些 circRNA 训练了多个分类模型,其中效果最好的一个分类模型(文中称为“Ccirc”)在训练集当中的 AUC 高达 0.820,拥有优秀的高级别前列腺癌区分能力。最后作者又在两个独立的验证集当中(数量分别高达 497 和 505)对训练出的分类模型进行了验证,结果发现 Ccirc 这个分类模型均拥有超过 0.8 的 AUC 值。相比于现行唯一临床可用的高级别前列腺癌生物标志物 PSA,该分类模型可以在更低浓度下进行检测,相当于仅需 2.0–10.0 ng/mL 浓度的 PSA 即可有效区分出高级别前列腺癌患者。

云序cfRNA产品线 

云序生物可提供多种多样的 cfRNA 测序组合,满足您个性化的 cfRNA 测序实验需求。

对于小 RNA,我们提供以下 cfRNA 测序服务:

cfRNA miRNA 测序 

cfRNA tsRNA测序(包含tsRNA和miRNA) 

cfRNA piRNA测序 (包含piRNA和miRNA) 

1.cfRNA small RNA测序 (包含miRNA,piRNA,tsRNA,rsRNA等多种sncRNA)

对于长链 RNA,我们提供以下 cfRNA 测序服务:

cfRNA mRNA测序 

cfRNA LncRNA测序 (包含mRNA和LncRNA) 

cfRNA  circRNA测序 (包含circRNA,LncRNA和mRNA) 

此外,我们还提供包含小 RNA 和长链 RNA 双文库在内的 cfRNA 全转录组测序服务:

cfRNA 全转录组测序 (包含mRNA,lncRNA,circRNA,miRNA,piRNA,tsRNA,rsRNA) 

云序客户cfRNA已发表论文 

往期回顾

云序客户白金期刊成果,外泌体竟是心肌损伤“罪魁”! 

外泌体miRNA项目文章|近15分外泌体小RNA文章助力医学治疗新思路